Как выбрать технологию секвенирования?

Секвенирование представляет собой метод определения последовательности нуклеотидов в цепочке ДНК или РНК. С помощью такого тестирования выявляются различные генетические аномалии, возникшие из-за структурного повреждения нуклеотидной цепочки. Секвенирование позволяет выявлять причины имеющихся генетических болезней или определять возможную предрасположенность к ним. В перспективе такая технология позволит заранее определять риск появления генетических отклонений у следующего поколения.

В каких случаях проводится секвенирование цепочек ДНК и РНК?

Анализ с помощью секвенирования может назначаться при наличии следующих показаний:

• Наличие множественных пороков развития у плода. Исследование позволяет определить их причину;
• Появление признаков наследственных заболеваний. Если патология была обнаружена у родителей, она может проявиться у детей. Исследование показывает, где именно возникла «поломка» гена;
• Наличие у детей признаков психомоторных нарушений, задержки развития, аутизма. Исследование позволяет установить, связаны ли они с генетическими отклонениями;
• Наличие недифференцированных наследственных синдромов.

Для точности получаемых результатов важен правильный выбор технологии секвенирования. Рассмотрим подробнее, как и при каких обстоятельствах проводится такое исследование.

Основные методики секвенирования

Принцип секвенирования, открывший новую эру в изучении человеческого генома, был открыт еще в 1977 году – с этого времени ученые получили возможность анализировать последовательный ряд нуклеотидов в цепочках ДНК и РНК. Первоначально такое исследование было возможным только в наиболее крупных исследовательских центрах, но благодаря развитию технологий сегодня оно может проводиться даже в небольших частных клиниках.

Секвенирование первого поколения по Сэнгеру

Метод Сэнгера стал первым результативным способом секвенирования и долгое время он оставался «золотым стандартом» в этой области. Методу существует и успешно применяется уже около 40 лет, он получил широкое распространение благодаря простоте и эффективности. Его принцип основан на синтезирование новой комплементарной цепи, в которую включаются модифицированные меченые нуклеотиды, с помощью которых прекращается синтезирование.

Метод предполагает несколько этапов:

• На начальном этапе запускается процесс термоциклирования для разрыва цепочки – по похожему принципу проводится реакция ПЦР. В раствор, с помощью которого выполняется секвенирование по этой технологии, включаются дидезоксинуклеотиды, причем для определенного основания используется свой вид флуоресцентного красителя.
• Следующей фазой становится термоциклирование. С помощью ДНК-полимеразы синтезируемая цепь получает комплементарные дезоксинуклеотиды (dNTP), процесс прекращается в момент добавления нуклеотида ddNTP. Хотя это событие можно назвать случайностью, благодаря большому количеству матриц, на которых протекает реакция, дидезоксинуклеотиды хотя бы один раз будут присоединяться к каждому из нуклеотидов в анализируемой генетической цепочке.
• Когда эта фаза завершается, а синтез обрывается, полученные фрагменты ДНК пропускаются сквозь капилляр со специальным гелем. Более мелкие фрагменты будут быстрее полностью проходить в отверстия полимерного материала, в результате будут отделены. Конец капилляра оснащен детектором, с помощью которого регистрируется краситель – по полученным результатам выстраивается хроматограмма.

В результате можно детально точно определить последовательность в исходной цепочке ДНК. Процесс почти полностью автоматизирован: возможности современного программного обеспечения позволяют проводить анализ с минимальным участием человека, в результате снижается риск ошибки из-за человеческого фактора.

Как проводится секвенирование второго поколения?

Хотя у секвенирования первого поколения много достоинств, технология требовала доработки из-за нескольких минусов. Исследование стоит достаточно дорого, кроме того, оно занимает немало времени. Со временем было разработано следующее поколение обновленных и улучшенных методик, которые позволили снизить стоимость исследований. С их помощью можно работать с фрагментированной ДНК, а также с короткими прочтениями.

Это поколение предполагает две основные технологии:

• Метод гибридизации. Эта технология впервые появилась уже в восьмидесятых годах, ее принцип основывался на применении меченых фрагментов, в которых последовательность цепочки нуклеотидов была уже известна. Массив помещался на фильтры. После на него наносилась ДНК, подлежащая анализу. Проводилась новая гибридизация, в ходе которой вымывались фрагменты, которые не прореагировали – вследствие этого выявлялись расхождения между цепочками на фильтре и исследуемыми фрагментами.
• Метод синтеза. Принцип работы предполагал выделение ДНК с помощью метода фрагментации с последующей очисткой образцов. С помощью приборов определялась последовательность нуклеотидов в каждом исследуемом фрагменте, а затем она выравнивалась по эталону. Такая технология одновременно организуется для нескольких млн. фрагментов ДНК, что обеспечивает точность результатов.

Секвенирование по технологии, разработанной компанией Illumina, предполагало несколько основных шагов:

1. Разделение цепочки ДНК на фрагменты;
2. Добавление к ним адаптеров;
3. Проведение денатурации и иммобилизации фрагментов ДНК;
4. Проведение амплификации;
5. Секвенирование, то есть получение отдельных участков цепочки.

В ходе первых подготовительных этапов создается библиотека для секвенирования, после чего ее образец размещается в проточной кювете. В нее также помещается раствор олигонуклеотидов – укороченных участков ДНК, комплементарных адаптерам. Они служат начальными участками для считывания цепочки нуклеотидов. Образцы проходят цикл амплификации, затем на иммобилизованном участке синтезируется цепь.

Далее создается кластер. Он предполагает проведение ряда последовательных циклов амплификации. Затем в резервуар вводится праймер, после чего запускается процесс секвенирования, напоминающий стандартную реакцию первого поколения. Однако по результатам происходит восстановление гидроксильной группы с удалением красителя.

Секвенирование с помощью синтеза по технологии GenoLab M

Ко второму поколению также относят технологию синтеза от конкурента Illumina: GeneMind Biosciences – новый метод представили в 2020 г.

Он основан на методике синтеза, а также обратимой терминации. Такая технология может использоваться при секвенировании геномов различных живых организмов, от растительных до человеческих. По производительности технология не уступает ранее разработанным методам, при этом цена проводимых исследований оказалась ниже.

Секвенатор GenoLab M. способен работать с теми же библиотеками, которые используются для платформы Illumina. Это позволяет успешно решать много задач, что обеспечило методу большие перспективы.

Секвенирование с применением наношариков

Принципиально иная технология была предложена концерном BGI Group – технология с применением наношариков впервые появилась в 1999 г. Ключевым преимуществом стала высокая скорость обработки образцов – платформа была рассчитана на проведение более 80 тысяч анализов в год. Это дало возможность использовать новый продукт при проведении масштабных генетических исследований в крупных центра, что обеспечило ему интерес научного сообщества.

Новая система получила несколько особенностей:

• Высокая степень автоматизации. Секвенатор рассчитан на круглосуточную автономную эксплуатацию при минимальном контроле со стороны сотрудников – в день он способен анализировать больше 60 проб.
• Наличие высокотехнологичного ПО, обеспечивающего максимальную точность результатов.
• Экономное секвенирование. Процесс с применением наношариков позволил оптимизировать затраты на проведение исследований.

Третье поколение

Генетические исследования продолжают активно развиваться – уже разработана новая технология секвенирования. С ее помощью можно изучать длинные прочтения, которые получили названия риды – это дало возможность анализировать данные метагеномов и эпигенетические маркеры. Однако пока технологии третьего поколения находятся в стадии разработки: по точности они уступают предыдущему поколению, при работе с новыми методами высок риск ошибок.

На какие параметры ориентироваться при выборе технологии секвенирования?

Выбор подходящей технологии секвенирования основан на поставленной задаче, области исследования, масштабности проекта, требованиях к длине прочтения.

Технология секвенирования по Сэнгеру используется преимущественно при исследованиях небольших масштабов: она остается востребованной при идентификации микроорганизмов, оценке подлинности клеточных линий, подтверждении редактирования генома и решении других задач, которые стали повседневной реальностью. Метод отличается невысокой производительностью, но при этом достаточно прост в применении.

Технологии второго поколения активно применяются при проведении крупномасштабных исследований – это позволяет получить высокую точность результатов и уменьшить затраты. Методы второго поколения используются при определении транслокации, дифференциации опухолей, секвенировании целых экзомов ДНК.

Получите подробные консультации специалистов компании «ЛидерМед Групп» при подборе лабораторного оборудования для проведения генетических исследований. На нашем сайте можно выбрать широкий спектр оснащения для специализированных лабораторных комплексов, возможны поставки комплектов оборудования. Стоимость рассчитывается индивидуально, предоставляется дополнительная информация по выбору техники. Возможны поставки оборудования по всей территории России. Для получения консультаций позвоните нам или оставьте запрос на сайте.